一文了解 MethylationEPIC 850K 甲基化芯片
要点:
● 编码区域与增强子区域范围广泛覆盖的唯一组合
每份样本分析超过850,000个甲基化位点,可达单核苷酸分辨率
● 实验分析方法可重现性高
技术平行重复性>98%
● 简单的工作流程
PCR-free(无需聚合酶链式反应)的操作,结合强大的Infinium HD Assay实验分析方法
● 与福尔马林固定、石蜡包埋样本兼容
可提供适用于福尔马林固定、石蜡包埋样本的甲基化研究实验方案
简介
DNA甲基化在调控基因表达中扮演了重要而动态的角色。细胞因此获得并维持特定状态,抑制病毒和非宿主DNA元件的表达,并促进对环境刺激的响应。异常的DNA甲基化(超或低甲基化)以及其对基因表达的影响已被证实与许多疾病相关联,包括癌症、神经疾病、衰老和发育等。
为了在更多应用领域提供更经济的DNA甲基化分析方案,Illumina提供了一种可靠的甲基化谱分析平台,其中包含成熟的试剂以及iScan和HiScan系统。过去五年的甲基化组研究中,包括ENCODE和FANTOM5等计划,已发现增强子区域包含差异性甲基化的关键位点。
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片(图1)基于业界领先的Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片的基础上开发,包含原有90%以上的CpG,外加新增的350,000个位于增强子区域的CpG。该实验分析方法能够在单个CpG位点的水平上提供定量甲基化测量,可适用于正常及福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)样本,为深入了解表观遗传变化提供了强大的检测分辨率。
图1:Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片
特有超过850,000个位于增强子区域、基因体、启动子和CpG岛上的CpG。
全面的全基因组覆盖度
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片非同一般地覆盖了CpG岛、RefSeq基因、ENCODE开放染色质、ENCODE转录因子结合位点以及FANTOM5增强子区域(图2)。Infinium HD技术能够使内容选择摆脱因甲基化DNA捕获方法的偏向性而受到的相关限制。
特征类型
覆盖数
覆盖 %
位点/特征平均数
岛
26,000
>95%
6
北岛岸
25,000
>90%
3.5
南岛岸
25,000
>90%
3.5
北岛架
22,000
>80%
2
南岛架
22,000
>80%
2
图2:Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片可对整个基因区域实现高密度覆盖
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片对基因区域、CpG岛/CpG岛区域、岛岸和岛架的广泛覆盖,可支持您获得最全面甲基化状态视图。
更重要的是,Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片包含了原先的Infinium Methylation450 BeadChip芯片90%以上的内容,这种选择可提供一种广泛、全面的甲基化组图谱。
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片靶定了ENCODE计划中确定为潜在增强子的区域。开放染色质、FAIRE实验分析方法和转录因子结合位点的ENCOD轨迹也同时被覆盖,以确定科研中基因组最活跃的区域(图3)。最后,芯片还靶定了FANTOM5计划在各种组织类型中确定出的增强子。结果包括泛增强子和编码区域的甲基化组图谱,可用于各种人类组织的表观基因组关联研究,同时包括甲基化专家所要求的以下内容类别:
● CpG岛以外的CpG位点
● 人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点(CHH位点)
● 肿瘤相对于正常(多种形式的癌症)及一些组织类型的差异甲基化位点
● FANTOM5增强子
● ENCODE开放染色质和增强子
● DNase超甲基化位点
● miRNA启动子区域
● Illumina HumanMethylation450 BeadChip芯片中90%以上的位点
特征类型
映射特征数
覆盖%
位点/特征
RefSeq
NM_TSS200
>33,000
>85%
3
NM_TSS1500
>38,000
>97%
5
NM_5′UTR
>31,000
>83%
7
NM_第一外显子
>33,000
>84%
2
NM_3′UTR
>27,000
>69%
1
NM_外显子边界
>36,000
>96%
0.5
NR_TSS200
>7000
>65%
1
NR_TSS1500
>9000
>84%
3
NR_外显子边界
>8000
>77%
0.2
GenCode Basic v12
TSS200
>114,000
>84%
2
TSS1500
>130,000
>87%
5
5′UTR
>83,000
>82%
7
第一外显子
>75,000
>57%
2
3′UTR
>63,000
>72%
3
外显子边界
>10,000
>30%
0.5
增强子
ENCODE开放染色质证据≥4
>153,000
>66%
2
开放染色质内的
ENCODE TFBS证
据≥3
>166,000
>72%
1
开放染色质内的
ENCODE TFBS证
据≥4
>142,000
>78%
3
FANTOM5增强子
>23,000
>83%
1
a. 碱基对内自转录起始位点起(TSS)的距离。
b. ENCODE开放染色质:具有≥4项证据证明处于DNaseI_FAIRE_ChIP_
Synthesis_from_ENCODE_OpenChrom_Duke_UNC_UTA内ENCODE轨迹开放染色质状态的基因组区域。
c. 开放染色质内的ENCODE TFBS:上述定义的ENCODE开放染色质区域也被确定为轨迹TFBS_PeakSeq-based_Peaks内的转录因子结合位点。如上所示,数据具有≥3和≥4项证据。
d. 通过FANTOM5计划确定为增强子的基因组区域。
图3:Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片可对整个增强子区域实现高密度覆盖
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片可高密度地覆盖甲基化专家所需的包括增强子区域在内的多种内容类别。
一体化的工作流程
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片具有用户友好、一体化的工作流程,不需要聚合酶链式反应。起始量要求很低(低至250 ng),使得DNA来源有限的宝贵样本能用以进行分析研究。Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片试剂盒包含了开展甲基化分析所需的所有试剂(除了亚硫酸氢盐转化试剂盒,需要单独购买以外)。
高质量的数据
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片应用Infinium I和II测序化学技术(图4),以增强甲基化分析的覆盖深度。新增加的Infinium II设计允许对单个微珠类型使用简并的寡核苷酸探针。这可实现一组分析最多可达三个潜在CpG位点中的甲基化,或非甲基化,而对考察的位点结果没有影响。Illumina的科学家严格检验每个产品,以确保其强大、高重复性的功能表现,让研究人员获得业界领先的体验。
图4:采用Infinium I和II实验分析方法设计实现广泛覆盖
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片采用Infinium I 和Infinium II 实验分析方法。Infinium I实验分析设计在每个CpG基因位点采用2种微珠类型,甲基化和未甲基化的状态各1个。Infinium II 设计采用1种微珠类型,在杂交后的单碱基延伸步骤中确定甲基化状态。
整合的分析软件
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的数据分析是由GenomeStudio Methylation Module模块所支持,让研究人员能够对小规模研究开展差异甲基化分析。GenomeStudio软件2011.1版特有高级可视化工具,让研究人员能够在单幅图中查看大量的数据,如热图、散点图和线图(图5)。
图5:采用Illumina GenomeStudio软件进行整合数据分析
GenomeStudio软件2011.1版支持在任何平台上进行DNA甲基化分析。数据以直观的图形显示(热图,左图)。基因表达数据可与甲基化项目轻松整合(右图)。
精确性和准确性
可重现性是根据技术平行重复所产生结果的相关性来确定的。Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片显示出平行复制之间的(r2>0.98)以及HumanMethylation450 BeadChip芯片之间的较强相关性(图6A和6B)。Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片显示出与全基因组亚硫酸氢盐测序之间的较高R2相关性(图6C)。
A. MethylationEPIC重复相关性
B. HumanMethylation450 vs. MethylationEPIC相关性
C. HumanMethylation450 vs. 全基因组亚硫酸氢盐测序
图6:Infinium甲基化技术显示出较高的可重现性以及与测序数据的相关性
A) Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片。
B) Infinium HumanMethylation450 Bead Array与Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片重叠内容上非癌症样本β值的比较显示出>98%的R2值。
C) 当在正常肺组织和肿瘤肺组织范围内与全基因组亚硫酸氢盐测序数据相比较时Infinium HumanMethylation450K数据显示出较高的甲基化检出相关性。
分析灵敏度
通过比较重复实验(8个生物学样本,每个样本两次技术重复)的结果,Illumina的科学家表明,Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片可准确检测出0.2的delta-beta值,且假阳性率低于1%。
内部质量控制
Infinium HD的实验分析方法通过相依样本和独立样本的对照可得到高质量的数据。Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片包含阴性对照,可以解释亚硫酸氢盐转化后的序列复杂度下降 GenomeStudio Methylation Module Software有一个集成的对照界面,可以轻松监控对照。对于大规模的研究,BeadArray Controls Reporter输出了一个易于扫描的excel文件,便于多个对照的快速分析。
与其他软件的高度兼容性
这些工具以及GenomeStudio Genome Browser展示了大量有用信息,如染色体坐标、GC百分比、CpG岛的位置,以及甲基化β值。对于大规模研究而言,现在有许多能在软件框架R语言下运行的免费分析包可供采用,可用于甲基化数据的归一化和差异分析。Illumina网站上还提供了教学视频,解释了这些数据分析包如何使用。
跨应用的高度兼容性
Infinium HD甲基化实验分析方法所产生的数据能够轻松地与Illumina其他应用的数据兼容,包括基因表达图谱。这让研究人员能够开展跨应用的分析,比如将基因表达的数据与Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的甲基化数据相整合。
福尔马林固定、石蜡包埋样本的甲基化研究
福尔马林固定、石蜡包埋样本的甲基化研究可通过Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片方案的改进版本来实现。该方案利用Infinium FFPE DNA Restoration Solution来产生稳定而可重复的结果(表2)。Illumina FFPE QC和Infinium HD FFPE DNA Restore Kit也包含在内。正常样本与福尔马林固定、石蜡包埋样本的FFPE DNA Restore Solution和MethylationEPIC BeadChip试剂盒都是相同的。分析福尔马林固定、石蜡包埋样本的研究人员应当严格按照Infinium HD FFPE Methylation Assay方案中的工作流程(手动或自动)进行操作,因为其涵盖了对每个试剂盒标准方案所作的重要更改。
表2:甲基化数据质量比较指标(标准方案与FFPE方案)
MethylationEPIC
BeadChip芯片
标准实验方案
福尔马林固定
石蜡包埋方案
技术平行重复
r2≥98%
r2≥98%
检测到的位点数
≥96%
≥90%
与TruSeq Methyl Capture EPIC协同使用
TruSeq Methyl Capture EPIC Library Prep Kit内包括的Panel,是一种基于富集的亚硫酸氢盐测序方法,反映和扩展Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的内容。研究人员可在芯片与测序技术之间无缝转移,利用Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片的低成本优势进行大规模筛查,并通过TruSeq Methyl Capture EPIC Library Prep Kit深入研究特定的样本或亚群。该组合技术代表了两个甲基化分析领域的巅峰。
结语
Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片是将全面、专家选择的覆盖度、高样本通量能力和实惠的价格结合于一体的唯一组合,这使其成为大样本量全基因组DNA甲基化研究的理想解决方案。
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